PN 23 27 03 01. Platforme electrochimice, enantioselective, inovatoare pentru diagnosticarea rapida si precoce a cancerului

Responsabil: Prof Dr habil, CSI Raluca-Ioana van Staden

1. Obiectivul proiectului:

Obiectivul principal al proiectului este scaderea mortalitatii datorata cancerului si imbunatatirea starii de sanatate a populatiei prin preventia si diagnosticarea precoce a cancerului utilizand screeningul de masa (sange, saliva, urina) cu platforme electrochimice, enantioselective, inovatoare in vederea identificarii enantiomerilor aminoacizilor – ca noi biomarkeri pentru cancerele: gastric, de colon, pulmonar, de san si cerebral.

2. Rezultate preconizatepentru atingerea obiectivului:

Rezultatele estimate sunt platforma electrochimica enantioselectiva inovatoare, tehnologia de constructive a ei si testele de screening pentru enantioanaliza aminoacizilor, la nivel TRL3. Lucrarile publicate, un posibil brevet si participarile cu lucrari la conferinte sunt un alt grup de rezultate foarte importante pentru vizibilitatea proiectului.

Faza 1/2023. Design-ul senzorilor multimode de tip 3D

Enantioanaliza leucinei în probe de sânge integral utilizând senzori stocastici enantioselectivi

Noutatea este dată de utilizarea N-metil-fullero-pirrolidinei ca modificator al pastelor de grafit/Fe₂O₃ și nanografene pentru designul senzorilor stocastici enantioselectivi și folosirea lor pentru enantioanaliza leucinei în probe de sânge integral, precum și de capacitatea metodei stocastice de a realiza o recunoaștere moleculară enantioselectivă a enantiomerilor urmată de cuantificarea acestora, ceea ce poate facilita un diagnostic de înaltă fiabilitate a cancerului de sân. Deși cea mai mare parte a lucrării prezintă analiza leucinei, și nu enantioanaliza acesteia, scopul principal al studiului este de a dezvolta o metodă de enantioanaliză mai fiabilă pentru determinarea D-, și L-leucinei în probe biologice, pentru a stabili rolul lor ca biomarkeri în diagnosticarea cancerului de sân.

Materiale si metode

Designul senzorului stocastic enantioselectiv a fost realizat după cum urmează: 100 mg de grafit/ nanopulberi de grafenă au fost amestecate cu 20 mg de N-metil-fullero-pirrolidină. La amestecul de pulbere de grafit s-au adăugat 10 mg de Fe₂O₃. La fiecare dintre pulberi s-au adăugat 30 μl de ulei de parafină pentru a forma o pastă omogenă. Fiecare dintre paste a fost plasată într-un tub de plastic 3D neconductor imprimat în laboratorul nostru cu ajutorul unei imprimante 3D. Diametrul interior al fiecărui tub a fost de 25µm, iar lungimea de 1cm. Un fir de Ag a fost utilizat pentru a conecta pasta cu circuitul extern.

Morfologia pastelor modificate a fost investigată cu ajutorul microscopiei electronice de scanare (SEM) (Inspect S, FEI Company, Țările de Jos). Pentru a obține o rezoluție bună a imaginilor microscopice, pastele au fost analizate cu ajutorul detectorului LFD (low vacuum), la o tensiune înaltă (HV) de 30 kV și la o mărire de 1600X. Morfologia suprafeței active a senzorilor stocastici este prezentată în Figura 1.

(a)

(b)

Figura 1. Imagini SEM pentru (a) senzorul stocastic enantioselectiv pe bază de pastă de grafit și (b) senzorul stocastic enantioselectiv pe bază de pastă de nanografene.

S-au putut observa aglomerări de particule și canale în formațiuni asimetrice.

In figura 2 sunt prezentate exemple de diagrame stocastice obtinute in urma analizei sângelui integral cu cei doi senzori.

(a)

(b)

Figura 2. Exemple de diagrame obținute in urma analizei probelor de sânge integral cu (a) senzorul stocastic enantioselectiv pe bază de pastă de grafit și (b) senzorul stocastic enantioselectiv pe bază de pastă de nanografene.

Rezultate și discuții

Caracteristici de răspuns

Modul stocastic a fost utilizat pentru determinarea caracteristicilor de răspuns ale senzorilor stocastici enantioselectivi. Caracteristicile de răspuns sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici enantioselectivi utilizați in enantioanaliza leucinei.

Senzor stocastic bazat pe N-metil-fullero-pirrolidina &	Leucină	Semnatura toff (s)	Ecuatia de calibrare^*, R	Sensibilitate, s^-1g^-1 L	Limita de determinare, ag L^-1	Domeniul liniar de concentratie, g L^-1
Grafit/Fe2O3	L	0.6	1/ton = 0.04 + 8.17 × 10^13C r=0.9993	8.17 × 10^13	10.00	1 × 10^-17 – 1 × 10^-5
	D	0.8	1/ton = 0.01 + 1.42 × 10^13C r=0.9994	1.42 × 10^13	100.00	1 × 10^-16 – 1 × 10^-9
Nanografena	L	2.2	1/ton = 0.02 + 3.44 × 10^12C r=0.9995	3.44 × 10^12	100.00	1 × 10^-16 – 1 × 10^-4
	D	0.9	1/ton = 0.02 + 1.35 × 10^15C r=0.9996	1.35 × 10^15	1.00	1 × 10^-18 – 1 × 10^-6

^*<C> = mol L^-1; <t_on> = s.

Toate caracteristicile de răspuns raportate în tabelul 1 au fost obținute prin aplicarea unui potențial de 125 mV față de Ag/AgCl (ca electrod de referință) la o temperatură constantă de 25˚C.

Semnăturile celor doi enantiomeri sunt diferite atunci când s-a utilizat același senzor stocastic, ceea ce dovedește că senzorii sunt enantioselectivi și că pot fi utilizați pentru testarea simultană a celor doi enantiomeri în probe biologice. Domeniile liniare de concentrație sunt largi: 12 domenii de concentrație pentru L-leucină, 7 domenii de concentrație pentru D-leucină atunci când s-a utilizat senzorul pe baza de grafit/Fe₂O₃ și 12 domenii de concentrație pentru D-leucină atunci când s-a utilizat senzorul pe baza de nanografene, permițând enantioanaliza leucinei în probe de sânge integral fata de starea de sănătate a persoanelor. S-au înregistrat limite de determinare foarte scăzute (determinate ca fiind cea mai mică valoare a concentrației din intervalul liniar de concentrație) - toate de ordinul de marime ag L^-1; pentru analiza L-leucinei, cea mai mică limită de determinare a fost înregistrată atunci când s-a utilizat senzorul stocastic enantioselectiv pe baza de grafit/Fe₂O₃, în timp ce pentru analiza D-leucinei, cea mai mică limită de determinare a fost înregistrată pentru senzorul stocastic enantioselectiv pe baza de nanografena. L-leucina a fost determinată cu cea mai mare sensibilitate atunci când s-a utilizat senzorul pe bază de grafit/Fe₂O₃, în timp ce D-leucina a fost determinată cu cea mai mare sensibilitate atunci când s-a utilizat senzorul pe bază de nanografene.

Selectivitatea senzorilor stocastici enantioselective

Selectivitatea senzorilor stocastici este dată de diferența dintre semnaturile (valorile t_off) înregistrate pentru enantiomerii de leucină și cele obținute pentru CA15-3, CEA, HER2, p53, Ki67, maspin, CA19-9, L-, și D-serina - biomarkerii obișnuiți utilizați pentru stabilirea diagnosticului de cancer mamar.

Tabelul 2. Selectivitatea senzorilor stocastici.

Senzor stocastic bazat pe N-metil-fullero-pirrolidina &	CA15-3	CEA	HER2	Maspin	Ki67	CA19-9	p53	L-leucina	D-leucina	L-serina	D-serina
	Semnatura (s)
Grafit/Fe2O3	1.1	1.5	2.2	1.9	3.0	2.4	3.5	0.6	0.8	0.2	1.7
Nanografena	0.2	0.6	3.0	2.5	3.2	2.8	1.7	2.2	0.9	1.3	2.0

Rezultatele prezentate în tabelul 2 au aratat că niciunul dintre biomarkeri investigati nu interferă în enantioanaliza leucinei.

Stabilitatea și reproductibilitatea masuratorilor

S-au realizat zece senzori stocastici enantioselectivi din fiecare dintre cele două tipuri de senzori pentru enantioanaliza leucinei. Caracteristicile de răspuns au fost măsurate zilnic timp de o lună. Nu s-au înregistrat modificări semnificative ale sensibilității, variația acesteia fiind mai mică de 0.15%, ceea ce dovedește reproductibilitatea fiecărui tip de senzor stocastic. După o lună de măsurători, variația sensibilităților înregistrate a fost mai mică de 1.2%, ceea ce a demonstrat că senzorii sunt stabili timp de cel puțin o lună.

Enantioanaliza leucinei și argininei – factor cheie pentru detectia precoce a cancerului pulmonar

Pasta nanocompozită ZnO/α-CD/nanoC preparată a fost utilizată pentru identificarea și cuantificarea L-leucinei D și L-argininei și a D și L-leucinei în probele de sânge. Această lucrare raportează studiul morfologiei caracterizarea electrochimică a noului nanocompozit. Nanostructurile de ZnO sunt ideale pentru aplicarea în producția de senzori și biosenzori sensibili datorită proprietăților lor remarcabile (inclusiv o bandă interzisă largă, o energie de legare a excitației mare, non-toxicitate, biocompatibilitate, durabilitate chimică și fotochimică și caracteristici puternice de comunicare electronică) [23]. Ciclodextrinele (CD) sunt o categorie nouă de oligozaharide ciclice care constau din șase (α-CD), șapte (β-CD) și opt (g-CD) unități de glucopiranoză. Moleculele CD menționate mai sus posedă un exterior hidrofil și un interior hidrofob. Moleculele CD prezintă o configurație chimică distinctă în formă de cupă, ceea ce le face potrivite pentru formarea de complexe moleculare [24].

Partea experimentală

Materiale si reactivi

Fluka (Buchs, Suedia) a furnizat uleiul de parafină (d₄²⁰, 0,86 g cm^-1), iar Sigma Aldrich a furnizat ferricianura de potasiu (K₃[Fe(CN)₆]), fosfatul monosodic (NaH₂PO₄), fosfatul disodic (Na₂HPO₄), nanopulberi de carbon (nano C), oxidul de zinc (ZnO), α-ciclodextrina (α-CD), D și L-arginină, D și L-leucină. Fosfatul monosodic și disodic au fost utilizate pentru a pregăti o soluție salină tampon de fosfat la pH 7,5. Apa deionizată a fost achiziționată prin intermediul unui Millipore Direct-Q3. Soluțiile de L- și D-arginină și L- și D-leucină au fost preparate prin metoda diluției în serie și tamponate cu ajutorul unei soluții saline tampon de fosfat (pH 7.50).

Echipament și metode

Măsurătorile electrochimice voltametrie ciclică (CV), spectroscopie de impedanță electrochimică (EIS) și metoda stocastică au fost efectuate cu ajutorul unui mini-potențiostat EmStat Pico conectat la un laptop care rulează software-ul PSTrace versiunea 5.8 (PalmSens BV, Houten, Țările de Jos) pentru colectarea datelor. Toate studiile electrochimice au fost efectuate la temperatura camerei folosind o celulă electrochimică standard alcătuită din trei electrozi: electrodul de lucru, electrodul de referință din argint/clorură de argint (Ag/AgCl; 0,1 M KCl) și contraelectrodul - Pt. Pentru ajustarea pH-ului s-a folosit un pH-metru Mettler Toledo. Morfologia materialelor studiate a fost investigată cu ajutorul microscopiei electronice de scanare (SEM) (Inspect S, FEI Company Netherlands). Materialele au fost analizate în modul de vid redus (detector ETD), și de înaltă tensiune (HV) 30 kV la o mărire de 1600. Toate măsurătorile au fost efectuate la temperatura ambiantă.

Construcția senzorului 3D α-CD/ ZnO/nanoC

Electrodul ZnO/nanoC a fost preparat prin amestecarea fizică a 100 mg de nanopulbere de carbon cu 10 mg de ZnO și 40 µL de ulei de parafină timp de 15-20 min până la formarea unei paste omogene. Electrodul modificat a fost preparat prin amestecarea fizică a 100 mg de nanopulbere de carbon cu 10 mg de ZnO și 100 µL de soluție de α-CD 10^-3 M. Pasta astfel formată a fost introdusă într-un tub cilindric, iar pentru crearea unei conexiuni electrice s-a folosit un fir de Ag. Electrodul a fost clătit în apă distilată înainte de fiecare măsurătoare. Suprafețele electrozilor au fost reînnoite prin lustruire pe folie de aluminiu până când s-a obținut o suprafață netedă. Senzorii au fost depozitați la temperatura camerei, într-un loc uscat și ferit de lumină atunci când nu sunt utilizați.

Metoda stocastică

Pentru detecția stocastică a fost aleasă o tehnică cronoamperometrică, măsurătorile valorilor ton și t_off au fost efectuate la un potențial constant de 200 mV față de Ag/AgCl. Electrozii au fost scufundați într-o celulă care conținea soluții standard de diferite concentrații de aminoacizi. Valorile t_on au fost citite pe diagramele înregistrate, iar ecuațiile de calibrare 1/t_on=f(Conc.) sunt determinate cu ajutorul statisticii (ecuația de regresie liniară). Concentrațiile necunoscute de aminoacizi din probele de sânge au fost determinate prin introducerea în ecuația de calibrare a valorii 1/t_on obținute după măsurătorile probelor. Semnătura aminoacizilor, care a fost citită ca valoare t_off în diagrame, a fost utilizată pentru analiza calitativă. Pe de altă parte, valoarea ton a fost identificată pentru a fi conectată la concentrația de aminoacizi prin intermediul ecuației de calibrare a senzorului.

Figura 1. Reprezentarea schematică a construcției microsenzorului stocastic 3D α-CD/ZnO/nanoC

a)	b)

Figura 2. Caracterizările SEM ale ZnO/nanoC (a) and α-CD/ ZnO/nanoC (b)

Rezultate și discuții

Caracterizare SEM

Metoda SEM a fost utilizată pentru a caracteriza morfologia suprafeței ZnO/nanoC (Figura 2a) și α-CD/ZnO/nanoC (Figura 2b). Studiul actual a arătat că pastele studiate au forme sferice, grupate în formațiuni asimetrice, cu dimensiuni de zeci de nanometri.

Caracterizarea electrochimică

Electrodul ZnO/nanoC și electrodul modificat α-CD/ZnO/nanoC, voltamogramele ciclice au fost înregistrate într-o soluție de electrolit de suport de 0,1 M KCl conținând 5 mM K₃[Fe(CN)₆] pentru studii electrochimice. Efectul electrocatalitic al α-CD este confirmat de electrodul α-CD/ ZnO/nanoC, care prezintă o intensitate puternică a curentului anodic și catodic și o separare mică a potențialului de vârf (figura 3a).

a)	b)

Figura 3. a) Voltamogramele ciclice ale ZnO/nanoC și α-CD /ZnO/ nanoC, obținute într-o soluție de 5 mM K₃[Fe(CN)₆], 0.1 M KCl, viteză de scanare 0.1 V/s. b) Graficul Nyquist ale ZnO/nanoC și α-CD/ ZnO/nanoC într-o soluție de 5 mM K₃[Fe(CN)₆] and 0.1 M KCl

În plus, metoda EIS a fost utilizată în continuare pentru a caracteriza electrozii într-o soluție de 5 mM K₃[Fe(CN)₆] cu KCl 0,1 M ca electrolit suport, într-un interval de frecvență de la 0,1 Hz la 10⁵ Hz cu E_dc = 0,200 V și E_ac = 0,01 V. După ajustarea datelor EIS, valoarea înregistrată a R_ct pentru electrodul gol a fost de 7561 W. Graficul Nyquist al electrodului gol prezintă un semicerc larg în intervalul de frecvențe înalte-medii care corespunde unei rezistențe electrice ridicate. Datorită conductivității crescute a materialului, R_ct a scăzut atunci când α-CD a fost aplicat ca modificator al ZnO/nanoC (R_ct = 5818 W). Acest lucru poate fi atribuit modificatorului α-CD care a îmbunătățit transportul de electroni între soluție și stratul de electrod. Prin urmare, rezultatele arată că α-CD poate funcționa ca un substrat electronic atractiv și poate spori suprafața și transportul de electroni.

Voltamogramele ciclice au fost înregistrate la diferite viteze de scanare (10 - 100 mV/s) pentru senzorul ZnO/nanoC și α-CD/ ZnO/nanoC în 5 mM K₃[Fe(CN)₆] conținând 0,1 M KCl pentru a determina modul în care modificarea suprafeței electrodului nemodificat schimbă efectul electrocatalitic asupra procesului redox. Pentru a estima suprafața activă (A) pentru fiecare senzor, Ip_a și Ip_c măsurate au fost reprezentate grafic în funcție de rădăcina pătrată a vitezei de scanare (ν^1/2) (figura 4b), iar suprafețele active ale electrozilor au fost determinate cu ajutorul ecuației Randles-Sevcik:

Ip_a = (2,69 × 10⁵) n^3/2 A C₀ D_R^1/2 ν^1/2 (1)

unde Ip_a este curentul anodic de vârf (A), n este numărul de electroni transferați (în acest caz, n =1), A este suprafața activă (cm²), C₀ este concentrația de K₃[Fe(CN)₆] (5 mM), D_R este coeficientul de difuzie al cuplului redox [Fe(III)(CN)₆]^3-/[Fe(II)(CN)₆)^4- (7,60×10^-6 cm² s ^-1) și ν este viteza de scanare (V s^-1). Suprafețele active calculate ale celor doi electrozi au fost următoarele: pentru electrodul nanoC/ZnO a fost de 0,0009 cm², iar pentru /ZnO/α-CD/nanoC a fost de 0,0012 cm². Datorită suprafeței crescute, electrocatalizei eficiente și conductivității ridicate, α-CD a îmbunătățit semnalul de răspuns al electrodului nemodificat și a accelerat transportul de electroni între analit și electrod.

a)	b)

Figure 4. a) Voltamogramele ciclice ale senzorului 3D ZnO/α-CD/nanoC înregistrate în domeniul 0.01 – 0.1 V/s într-o soluție de 5 mM K₃[Fe(CN)₆] conținând 0.1 M KCl; b) Dependența liniară a intensității anodice și catodice de potențial folosind ZnO/α-CD/nanoC

Caracteristicile de răspuns ale microsenzorului 3D and nanoC/ZnO/α-CD

Senzorii stocastici au o caracteristică de răspuns care se bazează pe conductivitatea canalului. Atunci când se aplică un potențial de 200 mV, molecula de aminoacid intră în canal și îl blochează. În același timp, intensitatea curentului scade până la 0 A. Cantitatea de timp care trebuie petrecută în acest tip de etapă este denumită semnătura aminoacidului. În etapa următoare, enantiomerul trece prin proceduri de legare, pe lângă activitățile redox. Cantitatea totală de timp care este petrecută în aceste procese este denumită t_on și este utilizată pentru măsurători cantitative. Caracteristicile de răspuns sunt prezentate în tabelul 1. Rezultatele demonstrează că senzorii sugerați sunt enantioselectivi; au fost obținute semnături distincte (valori t_off) pentru enantiomerii L și D ai argininei și leucinei, în ciuda faptului că în experiment a fost utilizat exact același senzor stocastic. Domeniile liniare de concentrație înregistrate pentru ambii aminoacizi cu microsenzorul 3D α-CD/ZnO/nanoC au fost foarte largi, iar nivelurile de interes sunt observate atât la persoanele sănătoase, cât și la pacienții care au fost diagnosticați cu cancer pulmonar Limitele de detecție scăzute de ordinul femtomolar au fost obținute cu microsenzorul 3D α-CD/ZnO/nanoC, cel mai mic LOD a fost obținut pentru D-leucină (0,03 fM).

Tabelul 1. Caracteristicile de răspuns ale microsenzorului stocastic 3D ZnO/α-CD/nanoC folosit pentru analiza enantiomerilor L- and D-Arginină și L- and D-Leucină.

Enantiomer	Semnătură (s)	Ecuație de calibrare*, r	Domeniu liniar de concentrație (mol L^-1)	Sensibilitate (s^-1 mol L^-1)	LOD (mol L^-1)
L - Leucină	1.4 ± 0.1	1/ton = 0.14 + 1.26 × 10^7× C r = 0.9928	10^-11 – 10^-8	1.26 × 10^7	3 × 10^-12
D - Leucină	0.8 ± 0.1	1/ton = 0.13 + 7.85 × 10^11× C r = 0.9995	10^-16 – 10^-11	7.85 × 10^11	3 × 10^-17
L - Arginină	2.1 ± 0.1	1/ton = 0.10 + 1.29 × 10^8× C r = 0.9852	10^-12 – 10^-9	1.29 × 10^8	3 × 10^-13
D - Arginină	1.8 ± 0.1	1/ton = 0.30 + 3.63 × 10^10× C r = 0.9999	10^-14 – 10^-11	3.63 × 10^10	3 × 10^-15

*<1/t_on > = s^-1; <C> = mol L^-1

Enantioanaliza serinei factor cheie în detectia timpurie a cancerul colorectal

Pentru identificarea celor doi enantiomeri de serină în probe biologice, cum ar fi sângele integral, saliva, țesuturile și urina, au fost propuși doi senzori stocastici pe bază de nanografene cu CuONPs modificate ulterior cu calix[6]arene și calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol (Schema 1).

Schema 1. Reprezentarea schematică preparării celor doi senzori stocastici 3D bazați pe nanografene și CuONPs modificați cu calix[6]arenă și calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol.

Partea experimentală

Reactivi și materiale

L-serină, D-serină, pulbere de nanografene, fosfat monosodic, fosfat disodic, sulfat de cupru (II) pentahidrat, hidroxid de sodiu, acid acetic, ferocianură de potasiu, acid clorhidric, calix[6]arenă, calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol, dimetilsulfoxid (DMSO) procurat de la Sigma Aldrich și ulei de parafină (d₄²⁰, 0. 86 g cm^-1) de la Fluka (Buchs, Suedia). În plus, probele biologice, cum ar fi sângele integral, urina, țesutul tumoral și saliva, au fost obținute de la pacienții cu CCR care nu au fost supuși niciunui tratament. Probele colectate nu au necesitat un tratament prealabil.

Soluția tampon de fosfat (PBS, 0,1 mol L^-1) a fost obținută prin amestecarea unei soluții de fosfat monosodic cu o soluție de fosfat disodic 0,2 mol L^-1 (8 ml), ajustarea pH-ului cu o soluție de acid clorhidric 0,1 mol L^-1 sau hidroxid de sodiu pentru a obține pH-uri diferite (7,4 și 3,0). Soluțiile de L- și D-serină au fost preparate în apă deionizată cu PBS. Atunci când nu au fost utilizate, soluțiile au fost păstrate într-un loc uscat și întunecos.

Echipament și metode

Echipamentul utilizat constă într-un mini potențiostat EmSTAT Pico conectat la un laptop. Cu ajutorul software-ului PsTrace versiunea 5.8 de la PalmSens s-au utilizat următoarele metode de analiză: voltametrie ciclică (CV), spectroscopie de impedanță electrochimică (EIS) și cronoamperometrie. Toate măsurătorile au fost efectuate la o temperatură de 22ºC. Celula electrochimică a fost formată din trei electrozi: electrodul de lucru realizat din pastă de nanografene modificată cu calix[6]arenă sau calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol, electrodul de referință Ag/AgCl (0,1 mol L^-1 KCl) și contraelectrodul, iar contraelectrodul fiind un fir de Pt. Valoarea pH-ului a fost verificată cu ajutorul unui pH-metru Mettler Toledo.

Sinteza nanoparticulelor de oxid de cupru - CuONPs

Sinteza nanoparticulelor de oxid de cupru s-a realizat prin amestecarea a 250 mL de sulfat de cupru pentahidrat 0,2 mol L^-1 cu 0.833 ml de acid acetic. Amestecul albastru-verzui a fost supus încălzirii, apoi s-au adăugat 10 mL de soluție de hidroxid de sodiu de 8 mol L^-1. Amestecul negru a fost agitat și încălzit timp de 2h. Suspensia neagră a fost lăsată să se răcească la temperatura camerei, a fost spălată de 5 ori cu apă deionizată și, în final, a fost calcinată timp de 3h (Karimi-Maleh et al., 2017).

Pregătirea senzorului CuONPs/nGr

Pentru a obține senzorul CuONPs/nGr, 90 mg de pulbere de nanografene și 20 µL de ulei de parafină au fost amestecate pentru a obține o pastă omogenă. S-au adăugat 10 mg de CuONPs (modificator) pentru a furniza canalele necesare pentru semnalul specific al senzorilor stocastici. Pasta modificată a fost plasată într-un tub de plastic neconductor și s-a folosit un fir de argint pentru a conecta contactul dintre pastă și circuitul extern.

Prepararea senzorilor 3D calix[6]arene/CuONPs/nGr și a senzorilor calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr

Prepararea senzorilor electrochimici modificați cu cele două calix-arene constă în utilizarea aceleiași matrice de CuONPs/nGr și a 100 µL de soluție de calix[6]arene sau calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol 10^-3 mol L^-1 preparată în DMSO.

Metoda stocastică

Pentru detecția stocastică, s-a ales o metodă cronoamperometrică, iar măsurătorile valorilor t_on și t_off au fost efectuate în raport cu Ag/AgCl la un potențial constant de 200 mV. Într-o celulă care conținea soluții standard de diferite concentrații de L- și D-serină, electrozii au fost imersați iar apoi valorile t_on au fost luate din diagramele înregistrate, și introduse în ecuațiile de calibrare de 1/t_on = f(Conc.) folosind ecuația de regresie liniară. Prin utilizarea valoarii 1/t_on dobândită după măsurătorile eșantioanelor în ecuația de calibrare, s-au calculat cantitățile necunoscute de L- și D-serină din probele de sânge, urină, salivă și țesut tumoral. Pentru analiza calitativă, au fost citite semnăturile L- și D-serinei (citite ca valoare t_off în diagrame) (figurile 3 și 4).

Figura 3. Identificrea L- și D-serinei folosind senzorul stocastic 3D calix[6]arena/CuONPs/nGr în probele biologice: a) salivă, b) sânge, c) țesut tumoral, d) urină.

Figura 4. Identificarea L- și D-serinei folosind senzorul stocastic calix[4]arena-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr în probele biologice: a) salivă, b) sânge, c) țesut tumoral, d) urină.

Probe biologice

Probele biologice au fost obținute de la Spitalul Clinic Județean de Urgență Târgu-Mureș, căruia i s-a acordat permisiunea de a efectua cercetarea de către Comitetul de Etică cu numărul 32647/14.12.2018, și de la Spitalul Clinic Județean Târgu-Mureș, căruia i s-a acordat permisiunea de a efectua cercetarea de către Comitetul de Etică cu numărul 3206/28.02.2019. Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții. Pentru această investigație, au fost utilizate patru tipuri de probe biologice de la pacienții confirmați cu CRC: sânge integral, țesut tumoral, urină și salivă. Aceste probe au provenit atât de la pacienți confirmați cu CRC, cât și de la voluntari sănătoși. Înainte de fiecare măsurătoare, nu a fost necesară nicio tratare prealabilă a probelor. Celula electrochimică a fost umplută cu diferitele probe biologice și, utilizând abordarea stocastică menționată mai sus, s-au calculat cantitățile necunoscute de L- și D-serină din probele biologice după înregistrarea diagramei și detectarea semnăturilor formelor enantiomerice de serină.

Rezultate și discuții

Caracterizarea SEM

Caracterizarea electrochimică a senzorilor 3D

Senzorul calix[6]arenă/CuONPs/nGr și calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr și CuONPs/nGr au fost caracterizate cu ajutorul CV și EIS. Pentru măsurătorile CV s-a utilizat o soluție de K₃[Fe (CN)₆] 5,0 x 10^-3 mol L^-1 în soluție de KCl 0,1 mol L^-1 în intervalul de potențial cuprins între -0,6 și 1,0 V, folosind următorii electrozi de lucru: calix[6]arene/CuONPs/nGr și calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr și CuONPs/nGr. În urma adăugării modificatorilor, se poate observa o îmbunătățire a activității electrochimice. Cel mai bun răspuns electrochimic este dat de senzorul calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr.

Pentru variația vitezei de scanare de la 0,010 la 0,100 V s^-1 s-a utilizat CV, după cum se poate observa în Fig. 5a. Obținând dependența liniară a intensității vârfurilor de potențial anodic și catodic și utilizând ecuația Randles-Sevcik, a fost calculată valoarea suprafeței electrocatalitic active a senzorului CuONPs/nGr (0.0018 cm²). Pentru senzorii modificați cu calix[6]arenă și calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol, s-au obținut arii active egale cu 0.0042 cm² și, respectiv, 0.0053 cm². Cea mai bună suprafață activă din punct de vedere electric a fost găsită în cazul senzorului calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr.

Analiza EIS a fost efectuată într-un interval de frecvență între 2,0 x 10⁵ și 1,0 x 10^-1 Hz măsurat într-o soluție de K₃[Fe (CN)₆] 5,0 x 10^-3 mol L^-1 în soluție de KCl 0,1 mol L^-1. Rezultatele pot fi observate în diagramele Niquist prezentate în Fig 5b. Semicercul mai mare corespunde senzorului CuONPs/nGr cu Rct=4,78 x 10⁵ Ω. Senzorii modificați cu calix[6]arene prezintă semicercuri mai mici în comparație cu senzorul nemodificat (Rct=1,78 x 10⁴ Ω pentru calix[6]arene/CuONPs/nGr). Senzorul calix[4]arene-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr prezintă cel mai mic semicerc, cu o valoare Rct de 1659 Ω. Aceste rezultate corespund rezultatelor obținute prin CV.

a)	b)

Figura 5. a) Voltamogramele ciclice înregistrate pentru senzorii stocastici 3D calix[6]arenă/CuONPs/nGr și calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr, obținute în 5 mM K₃[Fe(CN)₆] conținînd 0.1 M KCl la o viteză de scanare 0.1 V/s. b) Diagramele Nyquist înregistrate pentru senzorii stocastici 3D calix[6]arenă/CuONPs/nGr și calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol/CuONPs/nGr în 5 mM K₃[Fe(CN)₆] conținînd 0.1 M KCl.

Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici 3D

După cum s-a descris anterior, răspunsul senzorilor stocastici depinde de conductivitatea canalului. Determinarea valorii semnăturilor L- și D-serinei (t_off) a servit pentru analiza calitativă în diagramele obținute pentru probele biologice, în timp ce valorile ton au fost utilizate pentru determinarea caracteristicilor de răspuns ale senzorilor (tabelul 1), precum și pentru determinarea cantitativă a L- și D-serinei în probele biologice.

Tablelul 1. Caracteristicile de răspuns ale senzorilor stocastici enantioselectivi utilizați în enantioanaliza serinei

Senzori stocastici enantioselectivi bazați pe CuONPs/nGr	Serină	Semnătuă (s)	Ecuația curbei de calibrare*, r	Sensibilitate (s^-1 mol L^-1)	Limită de determinare (mol L^-1)	Domeniu liniar de concentrații (mol L^-1)
Calix[4]arenă-25,26,27,28-tetrol	pH = 7.4
	L	0.7	1/ton = 0.40 + 4.03 × 10^6× C r = 0.9939	4.03 × 10^6	1 × 10^-17	1 × 10^-17 - 1 × 10^-2
	D	0.3	1/ton = 0.50 + 3.78× 10^11× C r = 0.9996	3.78× 10^11	1 × 10^-18	1 × 10^-18 – 1 × 10^-2
	pH = 3.00
	L	0.8	1/ton = 0.63 + 3.75× 10^7 × C r = 0.9998	3.75 × 10^7	1 × 10^-17	1 × 10^-17– 1 × 10^-8
	D	0.5	1/ton = 0.35 + 56.10 × C r = 0.9999	56.10	1 × 10^-18	1 × 10^-18– 1 × 10^-4
Calix[6]arenă	pH = 7.4
	L	0.9	1/ton = 0.12 + 1.3 × 10^9× C r = 0.9998	1.31 × 10^9	1 × 10^-15	1 × 10^-15– 1 × 10^-8
	D	0.7	1/ton = 0.34 + 3.77 × 10^9 × C r = 0.9998	3.77 × 10^9	1 × 10^-17	1 × 10^-17– 1 × 10^-6
	pH = 3.00
	L	0.7	1/ton = 0.38 + 3.32 × 10^5 × C r = 0.9999	3.32 × 10^5	1 × 10^-16	1 × 10^-16– 1 × 10^-6
	D	0.5	1/ton = 0.29 + 2.08 × 10^8 × C r = 0.9999	2.08 × 10^8	1 × 10^-18	1 × 10^-18– 1 × 10^-8

*<C> = mol L^-1; <1/t_on > = s^-1

Faza 2/2023. Integrarea senzorilor multimode de tip 3D in platforme electrochimice, enantioselective inovatoare 3D.

Cateva platforme 3D sunt prezentate mai jos:

Schema 1. Platforma bazata pe senzori stocastici 3D pentru screening-ul rapid al sângelui și țesutului pentru cancerul cerebral.

Schema 2. Integrarea senzorilor 3D in platforma 3D pentru enantioanaliza cisteinei.

Schema 3. Integrarea senzorilor 3D in platforma 3D pentru enantioanaliza aminoacizilor cu rol de biomarkeri in cancerul cerebral.

Caracterizare preliminara a raspunsului platformelor 3D cand sunt utilizate la determinarea unor aminoacizi cum ar fi: citrulina, ornitina, alanine, arginina, asparagina, glutamate, glutamine, glicina, isoleucine, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofan, valina, aspartate, prolina, histidina. O caracterizare prealabila utilizand moduri cum ar fi: modul stochastic, DPV, potentiometria directa, ASV a senzorilor dupa integrarea in platforme a fost efectuata.

Caracterizarea preliminara a senzorilor 3D a fost efectuata utilizand diferite moduri: modul stocastic, DPV, potentiometria directa, ASV. In toate cazurile s-au obtinut sensibilitati mari si limite de determinare cuprinse intre 10^-18- 10^-21 g/mL. Unii enantiomeri au fost gasiti numai in probele biologice ale pacientilor diagnosticati cu cancer, putand fi considerati biomarkeri pentru diagnosticarea precoce a cancerului.

In faza urmatoare aceste platformele 3D vor fi caracterizate si utilizale la enantioanaliza aminoacizilor, testandu-se si potentialul lor de biomarkeri – cheie in detectia precoce a cancerului, utilizand un numar semnificativ de probe biologice.

Faza 3/2024.

Caracterizarea platformelor electrochimice, enantioselective inovatoare 3D

Design-ul si caracterizarea electrochimica a platformei stocastice 3D pentru determinarea precoce a cancerului de san

Platforma stocastică pentru detectarea argininei în sângele integral de la pacienți diagnosticați cu cancer de sân a fost realizată din Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE ca electrod de lucru, firul Ag/AgCl ca electrod de referință și firul Pt ca contraelectrod. Această platformă a fost caracterizată prin voltametrie ciclică (CV), spectroscopie de impedanță electrochimică (EIS) și microscopie electronică de scanare (SEM).

Caracterizarea CV și EIS

CV a fost utilizat pentru variația vitezei de scanare de la 0,010 la 0,100 V s^-1, după cum se poate observa în Fig. 1a. Obținând dependența liniară a intensității peak-urilor de potențial anodic și catodic și utilizând ecuația Randles-Sevcik, a fost calculată valoarea suprafeței electrocatalitic active a senzorului Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE (0,0031cm²). Pentru senzorii modificați cu Poly(L-Cys)/CPE și NiONPs/CPE, s-au obținut suprafețe active egale cu 0,0011cm² și, respectiv, 0,001cm². Cea mai bună arie activă din punct de vedere electric a fost găsită în cazul senzorului Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE.

Analiza prin EIS a fost efectuată într-o soluție de K₃[Fe (CN)₆] 5,0 x 10^-3 mol L^-1 (0,1 mol L^-1 KCl) la un interval de frecvență de 2,0 x 10⁵ până la 1,0 x 10^-1 Hz. Diagramele Niquist din Fig.3b prezintă rezultatele. Semicercul mai larg este în concordanță cu senzorul CPE Rct=1,0 106. Valorile Rct ale senzorilor modificați sunt de 3,7 × 10⁴ Ω pentru NiONPs/CPE și, respectiv, de 4,9 × 10⁴Ω pentru Poly(L-Cys)/CPE, mai mici decât cele ale senzorului original. Cu o valoare Rct de 2,1 × 10⁴ Ω, senzorul Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE prezintă cel mai mic semicerc. Aceste rezultate sunt în concordanță cu ceea ce s-a putut determina CV.

a)	b)

Figura 1. a) CV-urile şi b) Diagramele Niquist pentru senzorii stocastici Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE, NiONPs/CPE, Poly(L-Cys)/CPE şi CPE, analizaţi în soluţie de K₃[Fe(CN)₆] 5 mM în KCl 0,1 M la o viteza de baleiaj de 0,1 V/s.

Tabelul 1-Caracteristicile de raspuns ale platformei 3D bazata pe un seznor stocastic construit cu Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE

Amino acid	Platformă stocastică pe bază de Poly(L-Cys)/NiONPs/CPE
	toff (s)	Domeniu de concentraţie (mol L^-1)	Ecuaţia curbei de calibrare, r	Sensibilitatea (s^-1 mol^-1 L)	Limita de detecţie (mol L^-1)
L-Arg
D-Arg

Caracterizarea unei platforme 3D pentru screening-ul rapid al sângelui pentru cancerul pulmonar

Designul senzorului si platformei 3D stocastice

Eu2O3 a fost incorporat matricei CNP, care a fost modificata prin adaugarea in picatura a unei soluţii etanolice de oleamidă N10 de concentraţie 1.00×10^-3 mol L^-1. Pentru omogenitatea amestecului s-a adăugat ulei de parafină. Pasta a fost introdusa într-un tub de plastic tridimensional realizat în laboratorul nostru. Un fir de argint s-a folosit pentru a stabili legătură între pastă și circuitul extern. Platforma a fost asamblata prin integrarea senzorului în celula electrochimică și conectarea acestuia la un mini potențiostat. Senzorii 3D au fost spalati cu apă distilată si uscati după fiecare măsurătoare. Acestia au fost depozitați la frigider și protejați de expunerea la lumină atunci când nu sunt utilizați.

Caracterizarea pastelor

Morfologia pastelor a fost analizată folosind microscopia electronica de scanare (SEM). Micrografia SEM a pastei simple, indică o distribuție îngustă a particulelor de formă sferică ale materialului de carbon, așa cum se arată în Figura 1a. Figurile 1 (b și c) prezintă SEM-uri pentru Eu₂O₃ și oleamida N10 adaugate pastei de carbon. Nanoparticulele de Eu₂O₃ au acoperit consistent suprafața materialului de carbon. Particulele de oleamidă N10 au fost distribuite uniform pe suprafața materialului de carbon. Se poate observa clar modificarea pastei de carbon, formată prin stratificarea eficientă și uniformă a oleamidei și a nanoparticulelor Eu₂O₃ pe suprafața pastei, pentru a furniza canalele necesare unui răspuns stocastic, așa cum se vede în Figura 1d.

(a)	(b)
(c)	(d)

Figura 1. Imagini SEM pentru pastele (a) CNP, (b) Eu₂O₃/CNP, (c) N10 - CNP si (d) N10 - Eu₂O₃/CNP. Cercurile indică existența porilor în pasta N10 - Eu₂O₃/CNP.

Caracteristicile de raspuns ale platformei 3D

Prin metoda stocastică s-au determinat caracteristicile de răspuns ale platformei enantioselective pentru cei doi enantiomeri (Tabel 1).

Tabel 1. Caracteristicile de răspuns ale platformei stocastice enantioselective pentru determinarea L-Met si D-Met. (N=10)

Analit	Domeniul linear de concentratie (mol L^-1)	Ecuatia de calibrare si coeficientul de corelatie (r)*	toff (s)	Sensibilitatea (s^-1 mol^-1 L)	Limita de cuantificare (mol L^-1)
L-Met	1.00×10^-16 – 1.00×10^-8	1/ton=0.09+1.03×10^7×C; r=0.9990	1.9	1.03×10^7	1.00×10^-16
D-Met	1.00×10^-18 - 1.00×10^-2	1/ton=0.25+2.74×10^7×C; r=0.9999	0.5	2.74×10^7	1.00×10^-18

*C - concentratia= mol L^-1; t_on = s.

Limite de determinare scăzute au fost observate pentru enantiomeri, iar pentru D-Met chiar de ordinul atto mol L^-1. Sensibilitatea pentru ambii izomeri ai metioninei a prezentat un ordin de mărime comparabil de 10⁷.

Selectivitatea

Enantioselectivitatea platformei 3D a fost dovedită prin obținerea de valori t_off diferite pentru L-Met si D-Met, așa cum este prezentat în Tabelul 1. Pentru a evalua gradul de selectivitate, aminoacizi suplimentari precum L-, D-Arginina (L-, D-Arg) și L-, D-Leucina (L-, D-Leu) au fost alesi împreună cu alti biomarkeri utilizați în mod obișnuit pentru detectarea cancerului pulmonar, cum ar fi epiteliu pulmonar scuamos (CYFRA21-1), antigenul carcinoembrionar (CEA), factor de necroza tumorala (TNF-α), enolaza neuron specifica (NSE) si receptorul factorului de creștere epidermic uman (HER-1). Semnăturile observate pentru L-, D-metionina s-au dovedit a fi distincte de cele ale biomarkerilor menționați mai sus, indicând selectivitatea senzorilor 3D.

Platforme 3D pentru enantioanaliza lizinei în probele de sânge pentru depistarea precoce a cancer mamar

Designul senzorului 3D și al platformei stocastice

Pentru a obține un senzor 3D, a fost utilizată o matrice compusă din PbO2-rGO@Pd(0). Pentru a îmbunătăți semnalul electrochimic, a fost utilizat un modificator prin adăugarea în picatură a unei soluții care conține 4 terț-butil-calix[4]arenă la o concentrație de 10-3 M. Pentru a omogeniza amestecul, s-a utilizat în plus ulei de parafină. Pasta omogenizată a fost introdusă ulterior într-un tub de plastic tridimensional personalizat, fabricat în laboratorul nostru. Pentru a stabili o conexiune între pasta conținută în tub și circuitul extern, în tub a fost introdus un fir de argint. Platforma a fost construită prin încorporarea senzorului în celula electrochimică și cuplarea acestuia la un potențiostat miniatural. După fiecare utilizare, senzorul 3D a fost curățat cu apă deionizată și ulterior uscat. Ulterior, acesta a fost depozitat la temperatura camerei și protejat de lumină atunci când nu a fost utilizat.

Caracterizarea pastei

Analiza SEM arată că pasta modificată are o morfologie buna. În micrografia SEM, se poate observa că nanoparticulele de Pd sunt dispersate uniform pe toată suprafața structurii grafenei reduse. Observațiile făcute in urma analizei imaginii SEM, arată că particulele de oxid de plumb au o structura fină, iar morfologia particulelor este de tip tijă. De asemenea, se poate observa că 4-terț-butil-calix[4]arena a prezentat un model consistent și uniform de celule de formă pătrată. Particulele sunt rigide și s-au dezvoltat într-o direcție perpendiculară pe suprafață.

Figura 1. Imagine SEM pentru senzorul 3D integrat în platforma stocastică. Cercurile indică existența porilor în pastă.

Caracteristicile de raspuns ale platformei 3D stocastice

Metoda stocastică a fost folosită pentru determinarea caracteristicilor de răspuns ale platformei enantioselective (Tabel 1).

Tabel 1. Caracteristicile de răspuns ale platformei stocastice enantioselective pentru determinarea L-și D-lizinei. (N=10)

Analit	Domeniul linear de concentratie (mol L^-1)	Ecuatia de calibrare si coeficientul de corelatie (r)*	toff (s)	Sensibilitatea (s^-1 mol^-1 L)	Limita de cuantificare (mol L^-1)
L-lizină	1.00×10^-18 – 1.00×10^-9	1/ton=0.57+1.10×10^9×C; r=0.9999	0.6	1.10×10^9	1.00×10^-18
D-lizină	1.00×10^-18 – 1.00×10^-2	1/ton=0.08+5.88×10^9×C; r=0.9999	1.6	5.88×10^9	1.00×10^-18

*C - concentratia= mol L^-1; t_on = s.

Ambii enantiomeri au avut aceeași limită de determinare scăzută. În ceea ce privește sensibilitatea enantiomerilor, aceasta a prezentat un rezultat de ordin de magnitudine de 10⁹.

Selectivitatea

Valorile dinstincte obținute pentru L- și D-lizină indicate în Tabelul 1 demonstrează faptul că senzorul 3D propus este enantioselectiv. S-a demonstrat selectivitatea fata de: L-serina (L-ser), D-serina (D-ser), p53, antigenul carbohidrat 19-9 (CA19-9), antigenul carbohidrat 15-3 (CA15-3), antigenul carcinoembrionar (CEA), heregulina α (HRG-α), receptorul factorului de creștere epidermică uman (HER-1) și receptorul factorului de creștere epidermică uman (HER-2).

Faza 4/2024.

Validarea platformelor electrochimice, enantioselective inovatoare 3D

Enantioanaliza valinei în probele de sange – un factor cheie pentru diagnosticarea cancerului pulmonar

Design-ul sensorului stocastic Poly(ALR)/TiO₂/NC pentru enantioanaliza valinei în cancerul pulmonar

Matricea de lucru a senzorului stochastic a fost confecţionată din 43 mg nanopulbere de carbon şi 7 mg pulbere TiO₂ omogenizate cu 20 µL ulei de parafină rezultând o pasta omogenă. Depunerea de film a fost realizată prin electropolimerizare cu soluţie de Allura Red 10^-2 mol L^-1 preparată în apă deionizată. Numărul optim de cicluri de electrodepunere a fost de 15. Senzorul a fost integrat intr-o platforma inteligenta de tip 3D, capabila sa transmita rezultatele obtinute, la distanta.

Validarea platformei 3D

În scopul determinării enantiomerilor valinei am analizat un eşantion de 20 probe de sânge integral dintre care 10 apaţin unor voluntari sănătoşi şi 10 aparţin unor pacienţi confirmaţi cu cancer pulmonar. Probele au fost procurate de la Spitalul Universitar de Urgenţă, Bucureşti (Comitetul de etică 11/2013). Rezultatele analizelor au confirmat prezenţa enantiomerului D- în sângele integral sl pacientilor confirmaţi cu cancer pulmonar, iar în cazul pacienţilor sănătoşi este prezent doar enantiomerul L- (Tabelele 1 şi 2).

Tabelul 1 Enantioanaliza valinei în sângele integral al voluntarilor sănătoşi

Nr. probă	L-Val, pmol L^-1
1	11.71 ± 0.01
2	142.63 ± 0.04
3	8.35 ± 0.02
4	6.70 ± 0.01
5	11.24 ± 0.01
6	39.32 ± 0.02
7	9.51 ± 0.03
8	5.54 ± 0.01
9	13.85 ± 0.02
10	10.67 ± 0.01

Tabelul 2 Enantioanaliza valinei în sângele integral al pacienţilor confirmaţi cu cancer pulmonar

Nr. probă	Enantiomeri		Recovery, %
			L-Val	D-Val
	L-Val, pmol L^-1	D-Val, pmol L^-1	99.87 ± 0.02 %	99.93 ±0.04 %
1	18.6 ± 0.02	3.12 ±0.01
2	4.22 ± 0.03	116.25 ±0.05
3	1.46 ± 0.01	320.32 ± 0.02
4	4.24 ± 0.02	70.56 ± 0.03
5	11.09 ± 0.01	279.50 ± 0.02
6	26.87 ± 0.02	12.97 ± 0.02
7	7.58 ± 0.01	687.60 ± 0.03
8	46.16 ± 0.02	44.85 ± 0.03
9	18.60 ± 0.01	99.94 ± 0.01
10	99.99 ± 0.01	3.78 ± 0.04

Validarea platformei stocastice utilizate la determinarea simultană a L- și D-argininei în cancerul de sân

S-au utilizat probe de sânge integral al pacienților, asa cum a fost colectat de la pacienti. Pentru a calcula concentrațiile de L- și D-arginină în fiecare dintre enantiomerii L- și D, au fost efectuate măsurători ale valorilor t_on - care se obțin între două valori t_off consecutive. Pentru analiza L- și D-argininei în probele de sânge integral, au fost efectuate studii de validare. Pentru a afla dacă raportul enantiomerilor a afectat în vreun fel fiabilitatea enantioanalizei argininei, s-au facut determinari ale unui enantiomer in prezenta celuilalt pentru diferite rapoarte intre enantiomerii L- si D- ai argininei.

Tabelul 1 Enantioanaliza argininei în sângele integral al pacienţilor confirmaţi cu cancer mamar

Numărul probei	Arginina	Regăsirea (%) nmol L^-1
1	L
	D
2	L
	D
3	L
	D
4	L
	D
5	L
	D
6	L
	D
7	L
	D
8	L
	D
9	L
	D
10	L
	D

Tabelul 2 Enantioanaliza argininei în sângele integral al pacienţilor sănătoşi

Numărul probei	Arginina	Regăsirea (%) nmol L^-1
1	L
	D
2	L
	D
3	L
	D
4	L
	D
5	L
	D
6	L
	D
7	L
	D
8	L
	D
9	L
	D
10	L
	D

Rezultatele au aratat o buna fiabilitate a senzorului propus pentru enantioanaliza argininei.

Enantioanaliza L- si D-metioninei in probe de sange integral

Rezultatele obținute pentru cele zece probe de sânge integral de la pacientii cu cancer pulmonar, precum și pentru cele zece probe de sânge integral prelevate de la pacienti sănătoasi, sunt prezentate în Figura 1. Probele au fost analizate prin abordarea stocastică utilizând platforma stocastica enantioselectiva 3D. Determinarea izomerilor L și D din probe s-a realizat prin analiza semnăturilor lor distincte, a valorilor t_off, așa cum este reprezentat în Figura 1. Determinarea concentrațiilor enantiomerice a fost realizată prin utilizarea formulelor de calibrare corespunzătoare pentru fiecare enantiomer, valorile t_on obținute prin măsurarea timpului dintre două valori consecutive de t_off.

Figura 1. Enantioanaliza metioninei în probele de sange integral folosind platforma stocastică 3D.

Eficacitatea testelor de screening efectuate folosind senzorul stocastic enantioselectiv 3D a fost demonstrată prin adăugarea sistematică de L- si D-Met in probe de sange integral. Testele de recuperare au fost efectuate pe probe biologice care conțin cei doi enantiomeri in diferite proportii. Distribuția enantiomerilor L și D în metionina nu are niciun impact asupra recuperării individuale.

Rezultatele obtinute arata prezența izomerilor L și D în sânge pentru pacientii diagnosticați cu cancer pulmonar, iar in sangele pacientilor sanatosi fiind identificati numai izomerii L. Mai mult, excesul enantiomeric ar putea servi ca o caracteristică distinctivă în progresia cancerului.

Faza 5/2025.

Design-ul senzorilor multimode de tip 2D

Exemple de senzori 2D construiti utilizand material ceramic drept suport :

1. Senzor SWCNT serigrafiat decorat cu nanocompozit ATO-g-CD

Sinteza nanocompozitului ATO-g-CD Sinteza pentru nanocompozitul ATO-g-CD a fost realizată printr-o metodă sonochimică adaptată. 1 g ATO nanopulbere și 0,1 g g-CD au fost dispersate în 40 ml apă dublu distilată. După amestecare timp de 30 de minute, soluția de amestec dispersată a fost agitată bine prin metoda ultrasonică timp de aproximativ 2 ore. Nanocompozitul ATO-g-CD a fost centrifugat și filtrat folosind etanol și apă dublu distilată și uscat la 80°C peste noapte. Ulterior, nanocompozitul uscat ATO-g-CD a fost redispersat în apă pentru a obține o soluție omogenă de suspensie. Apoi, un volum de 8 μL suspensie de nanocompozit ATO-g-CD a fost aplicată pe suprafața electrodului SWCNT la temperatura ambiantă folosind tehnica standard de turnare în picătură și ulterior uscată la temperatura camerei.

Prepararea senzorului 2D Electrodul SWCNT a fost spălat cu apă și apoi activat în 0,5 M H₂SO₄ timp de cinci cicluri consecutive la o rată de baleiaj de 0,1 V/s, într-un interval care începe de la ˗0,2 până la + 1,3 V. După activarea electrodului SWCNT, pe suprafața electrodului s-a aplicat un volum de 8 μL din suspensia nanocompozit ATO-g-CD, utilizând tehnica standard de turnare în picătură și ulterior uscat la temperatura camerei. În această lucrare, ceilalți electrozi modificați au fost obținuți cu proceduri similare pentru comparație.

2. Prepararea senzorului β-CD/Pd-Au@ZnO/SPCNFE

Electrodul SPCNF a fost curățat cu apă deionizată și apoi activat utilizând metoda voltametriei ciclice într-o soluție de H₂SO₄ 0,5 M. Metoda de activare a constat în efectuarea a cinci cicluri la o viteză de scanare de 0,1 V s⁻¹, acoperind un interval de potențial de la −0,2 V la +1,3 V. Integrarea nanoparticulelor de Pd-Au@ZnO cu β-ciclodextrina (β-CD) a fost realizată printr-o metodă sonochimică simplă. Mai exact, 20 mg de nanoparticule de Pd-Au@ZnO și 28 mg de β-CD au fost dispersate în 20 mL de apă deionizată. Dispersia obținută a fost inițial amestecată timp de 50 de minute la vortex, apoi supusă unui proces de ultrasonicare timp de 2 ore pentru a asigura o omogenizare completă. Ulterior, 6 μL din suspensia de β-CD/Pd-Au@ZnO au fost depuse pe suprafața electrodului SPCNF printr-o tehnică simplă de drop-casting la temperatura camerei și apoi lăsate să se usuce complet timp de 1 ora. După fabricare, toți electrozii modificați au fost păstrați în condiții ambientale.

3. Designul senzorului 2D bazat pe Au@SPE

Pentru analiza glutaminei, s-a construit un sensor de aur serigrafiat modificat cu maltodextrina. Suprafața electrodului stocastic serigrafiat și suprafața electrodului auxiliar sunt pe bază de pelicule de aur, în timp ce suprafața electrodului de referință este pe bază de argint (numit Au@SPE). Suprafața activă a electrodului serigrafiat stocastic a fost modificată cu ajutorul unei soluții de MDI; 20μL de soluție de MDI (10^-3 mol L^-1) au fost depuse prin picatura pe suprafața activă și a fost lasat să se usuce pentru o perioadă de 2 ore la temperatura camerei, ferit de lumina. Înainte și după fiecare măsurare, senzorul a fost curățat cu apă deionizată. Atunci când nu a fost utilizat, senzorul stocastic MDI/Au@SPE a fost păstrat la temperatura camerei, într-un loc uscat.

4. Prepararea AgNPs@p(SY-co-L-met)/SPCE

Înainte de modificare, electrodul SPCE a fost clătit cu apă deionizată și activat folosind o soluție de H₂SO₄ 0.5 mmol L^–1 prin voltametrie ciclică (CV) în intervalul de potential de −0.2 până la +1.3V, cu o viteză de scanare de 0.1 V s^–1, timp de 5 cicluri. Pentru prepararea AgNPs@p(SY-co-L-met)/SPCE, 100.0 μL dintr-o soluție conținând 6.0 mmol L^–1 AgNO₃, electrolit suport KNO₃ 0.1 mol L^–1, Sunset Yellow 1.0 mmol L^–1 și L-metionină 1.0 mmol L^–1 a fost picurată pe SPCE activat, iar apoi au fost aplicate 9 cicluri voltametrice succesive (domeniu de potențial: –0.6 până la +1.6 V; viteză de scanare: 0.05 V s^–1) pentru electrodepunerea simultană a nanoparticulelor de argint (AgNPs) și electrocopolimerizarea L-metioninei și Sunset Yellow. În mod similar, în aceleași condiții de lucru, au fost pregătite și AgNPs/SPCE, AgNPs@p(L-met)/SPCE și AgNPs@p(SY)/SPCE folosind soluțiile corespunzătoare. Ulterior, electrozii modificați au fost clătiți apă deionizată.

Electrodepunerea și electrocopolimerizarea simultană pe SPCE

Performanța electrochimică a electrodepunerii simultane a nanoparticulelor de argint și electrocopolimerizării Sunset Yellow și L-metioninei a fost investigată prin CV, utilizând KNO₃ 0.1 mol L^–1 ca electrolit suport. Procesul a fost analizat prin observarea variațiilor intensității curentului în timpul fiecărui ciclu. Măsurătorile CV înregistrate în timpul electrodepunerii și electrocopolimerizării simultane sunt ilustrate în Fig. 1a. Pentru a identifica numărul optim de cicluri de potențial necesare pentru dezvoltarea AgNPs@p(SY-co-L-met)/SPCE, a fost pregătită o serie de senzori folosind un număr variabil de cicluri voltametrice (3, 5, 7, 9, 11). Ulterior, electrozii au fost analizați prin CV într-o soluție de K₃[Fe(CN)₆] 1.0 mmol L^–1 conținând KCl 0.2 mol L^–1 iar rezultatele sunt prezentate în Fig. 7b. Se observă o creștere a intensității curentului până la un număr optim de cicluri, urmată de o scădere, ceea ce indică formarea unui strat gros de copolimer care reduce conductivitatea electrică. Prin urmare, s-a stabilit că eficiența optimă a procesului de electrodepunere-electrocopolimerizare este atinsă prin utilizarea a 9 cicluri.

(a)	(b)
Fig. 1. (a) Voltamograme ciclice care ilustrează electrodepunerea și electrocopolimerizarea simultană a AgNO3 6.0 mmol L^–1, Sunset Yellow 1.0 mmol L^–1 și L-metionină 1.0 mmol L^–1 în KNO3 0.1 mol L^–1 electrolit suport în intervalul de potențial de –0.6 până la 1.6 V, timp de 9 cicluri, cu o viteză de scanare de 0.05 V s^–1 pentru obținerea AgNPs@p(SY-co-L-met)/SPCE; (b) Intensitatea curentului în funcție de numărul de cicluri necesare pentru obținerea AgNPs@p(SY-co-L-met)/SPCE.

5. Exemplu de design al unui senzor construit pe support hartie:

Pentru a obține un sensor stocastic de unică folosință de tip 2D, a fost utilizată o matrice pe bază de hârtie de xerox, pe care au fost depuse ca mono film cantități cunoscute de grafenă și cupru, iar senzorul a avut următoarea denumire: Graph+Cu 259 beta. Timpul de depunere a celor două materiale a fost de 6 minute. Pentru îmbunătățirea semnalului electric, senzorul a fost imersat într-o soluție de α-ciclodextrină (α-CD) de concentrație 10^-3 M, pentru o perioadă de 2 ore, apoi au fost lăsați la uscat pentru 24 ore, pentru a putea fi utilizați.

6. Exemplu de design al unor senzori bazati pe material textil – matase:

Doi senzori denumiti Gr+Cu258 beta si Gr+Cu262 beta, au fost obtinuti prin depunerea de straturi de nanocompozit Cu-Gr pe țesătură de mătase (care măsoară 210×297 mm) folosind tehnica cu plasmă rece; senzorii au fost modificați ulterior cu clorhidrat de octakis(6-deoxi-6-(2-aminoetil)tio)-gamma-ciclodextrină (CysGCD) pentru evaluarea biomedicală prin metoda stocastică. Senzorul Gr+Cu258 beta s-a obtinut prin depunerea nanocompozitului Cu-Gr in 6 minute, iar senzorul Gr+Cu262 beta prin depunerea nanocompozitului Cu-Gr in 12 minute. Configurații similare ale metodei cu plasmă rece (metoda cu plasmă cu arc termoionic în vid) au fost utilizate pentru obținerea de senzori, iar aplicabilitatea acestora sunt mentionate in literatura.

Fasii din tesaturile de matase Gr+Cu258 beta si Gr+Cu262 beta au fost imersate timp de 2 ore în 1.5–2 mL soluție de CysGCD 1.00×10⁻³ mol L⁻¹ preparată în apă distilată, apoi s-au lăsăt la uscat pentru 24 de ore înainte de utilizarea lor în studii. Senzorii modificati CysGCD/Gr + Cu258 beta si CysGCD/Gr + Cu262 beta au fost pastrati la temperatura camerei pana la utilizare.

Diseminarea rezultatelor

Lucrari publicate in reviste ISI

1. 2D enantioselective disposable stochastic sensor for fast real-time enantioanalysis of glutamine in biological samples

RI Stefan-van Staden, MI Bogea, RM Ilie-Mihai, DC Gheorghe, M Badulescu

Symmetry, 15, 958, 2023

2. Enantioanalysis of leucine in whole blood samples using enantioselective, stochastic sensors

RI Stefan-van Staden, OR Musat

Chemosensors, 11(5), 259, 2023

3. Enantioanalysis of serine using stochastic enantioselective sensors

RI Stefan-van Staden, CB Ion, R Georgescu-State

J Electrochem Soc, 170(11), 117516, 2023

4. Dеvеlopmеnt аnd vаlidаtion of а plаtform bаsеd on 3D stochаstic sеnsors for fаst scrееning of wholе blood аnd brаin tissuе for brаin cаncеr

C Cioаtеs Nеgut, RI Stеfаn-vаn Stаdеn, JF vаn Stаdеn

Microchem. J., 200(5), 110313, 2024

5. Enantioanalysis of cysteine using an enantioselective stochastic platform – a key factor on early diagnosis of breast cancer

C Cioates Negut, RI Stefan-van Staden

J Electrochem Soc, 171 (3), 037518, 2024

6. Enantioanalysis of leucine and arginine – a key factor in lung cancer metabolomics

IR Comnea-Stancu, RI Stefan-van Staden, JF van Staden

J Electrochem Soc, 171(6), 067513, 2024

7. An electrochemical 3D platform based on poly (alizarin red S) and magnetite nanoparticles for fast enantiorecognition and determination of tryptophan enantiomers in whole blood samples

R Georgescu-State, RI Stefan-van Staden, JF van Staden, RN State

Electrochim Acta, 501, 144774, 2024

8. An enantioselective portable stochastic platform for quick screening of whole blood for methionine enantiomers

C. Cioates Negut, R.I. Stefan-van Staden, R.M. Ilie-Mihai

Microchem J., 205, 111383, 2024

9. Enantioanalysis of lysine in whole blood – a test that may contribute to early diagnosis of beast cancer

D.C. Gheorghe, R.I. Stefan-van Staden

UPB Sci Bull, 86(4), 19-28, 2024

10. An enantioselective stochastic miniplatform based on a sensor designed using poly-Allura Red, TiO2 and carbon nanopowder for enantioanalysis of valine in whole blood samples

RI Stefan-van Staden, CB Ion, JF van Staden

Microchem. J., 212, 113456, 2025

Premii

Premiul Societatii de Chimie din Romania

Titlu: ENANTIOSELECTIVE DETERMINATION OF CYSTEINE IN WHOLE BLOOD SAMPLES USING ANOVEL 2D ELECTROCHEMICAL SENSOR

Autori: Bianca-Maria TUCHIU-STANCA, Raluca-Ioana STEFAN-VAN STADEN, Jacobus (Koos) Frederick VAN STADEN

Conferinta: Workshop-ul exploratoriu NEXT-CHEM, editia a VII-a"Tehnologiiinovatoare trans-sectoriale", 22-23 mai 2025; Sectiunea: Multifunctional materials, nanocomposites, innovative technologies and cultural heritage preservation (MTCH)

Diplome

Bianca-Maria TUCHIU-STANCA, PREMIUL Societății de Chimie din România pentru lucrarea ENANTIOSELECTIVE DETERMINATION OF CYSTEINE IN WHOLE BLOOD SAMPLES USING A NOVEL 2D ELECTROCHEMICAL SENSOR, Workshop-ul exploratoriu NEXT-CHEM, ediia a VII-a "Tehnologii inovatoare trans-sectoriale", 22-23 mai 2025